Produkty

Sposób, w jaki skutki jednoczesnych mutacji łączą się ze zmianą aktywności enzymatycznej, nie jest łatwy do przewidzenia, ponieważ efekty te nie zawsze sumują się w sposób liniowy.Dlatego charakterystyka efektów jednoczesnych mutacji reszt aminokwasowych wiążących substrat może wnieść znaczący wkład w zrozumienie specyficzności substratowej enzymów.W beta-glikozydazie Spodoptera frugiperda (Sfbetagly) obie reszty Q39 i E451 oddziałują z substratem, co jest niezbędne do określenia specyficzności substratu.Podwójne mutanty Sfbetagly (A451E39, S451E39 i S451N39) przygotowano przez mutagenezę ukierunkowaną, eksprymowano w bakteriach i oczyszczono stosując chromatografię powinowactwa.Enzymy te scharakteryzowano stosując jako substraty p-nitrofenylo-beta-galaktozyd i p-nitrofenylo-beta-fukozyd.Stosunek k cat/Km dla pojedynczych i podwójnych mutantów Sfbetagly zawierających ukierunkowane mutacje w pozycjach Q39 i E451 wykorzystano do wykazania, że ​​wpływ podwójnych mutacji (Gdouble daggerxy) nie jest sumą efektów wynikających z pojedynczych mutacji (Gdouble daggerx i Gdouble daggery).Ta różnica w sztylecie Gdouble wskazuje, że efekty pojedynczych mutacji częściowo się pokrywają.Dlatego ten wspólny efekt liczy się tylko raz w Gdouble daggerxy.Dane krystalograficzne dotyczące beta-glikozydaz ujawniają obecność dwukleszczowego wiązania wodorowego obejmującego reszty Q39 i E451 oraz tę samą grupę hydroksylową substratu.Dlatego zarówno dane termodynamiczne, jak i krystalograficzne sugerują, że reszty Q39 i E451 wywierają wzajemny wpływ na ich odpowiednie interakcje z podłożem.