Produkty

Nowy test wysokosprawnej chromatografii cieczowej dla glikozylotransferaz oparty na derywatyzacji kwasem antranilowym i detekcji fluorescencyjnej.

Testy zostały opracowane przy użyciu unikalnej chemii znakowania kwasu 2-aminobenzoesowego (2AA; kwasu antranilowego, AA) do pomiaru aktywności zarówno β1-4 galaktozylotransferazy (GalT-1), jak i α2-6 sialilotransferazy (ST-6) za pomocą cieczy o wysokiej wydajności chromatografia (HPLC) z detekcją fluorescencji (Anumula KR. 2006. Postępy w metodach derywatyzacji fluorescencji dla wysokosprawnej chromatografii cieczowej do analizy glikoprotein węglowodanów. Anal Biochem. 350:1-23).N-acetyloglukozaminę (GlcNAc) i N-acetylolaktozaminę zastosowano jako akceptory, a difosforan urydyny (UDP)-galaktozę i monofosforan cytydyny (CMP)-kwas N-acetyloneuraminowy (NANA) jako donory odpowiednio dla GalT-1 i ST-6.Produkty enzymatyczne znakowano in situ za pomocą AA i oddzielano od substratów na kolumnie TSKgel Amide 80 w warunkach normalnej fazy.Jednostki enzymu określono na podstawie powierzchni pików przez porównanie z jednocześnie derywatyzowanymi standardami Gal-β1-4GlcNAc i NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Ustalono liniowość (czas i stężenie enzymu), precyzję (wewnątrz- i między testami) oraz powtarzalność testów.Testy okazały się przydatne w monitorowaniu aktywności enzymów podczas izolacji i oczyszczania.Testy były bardzo czułe i przeprowadzone na poziomie równym lub lepszym niż tradycyjne pomiary na bazie cukru radioaktywnego.Format testu można również wykorzystać do pomiaru aktywności innych transferaz, pod warunkiem, że akceptory węglowodanów zawierają koniec redukujący do znakowania.Opracowano test akceptorów glikoprotein z użyciem IgG.Opracowano krótką metodę profilowania HPLC do rozdzielania glikanów IgG (biantenarne G0, G1, G2, mono- i disialilowane), co umożliwiło szybkie oznaczenie aktywności GalT-1 i ST-6.Ponadto ta metoda profilowania powinna okazać się przydatna do monitorowania zmian glikanów IgG w warunkach klinicznych.