Produkty

Aby konkretnie określić ilościowo kilka metabolitów 5-fluorouracylu (5-FU) i dwóch endogennych nukleotydów monofosforanowych, opracowaliśmy oryginalną metodę opartą na tandemowej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS/MS).Badanie to umożliwiło określenie: (i) wewnątrzkomórkowej produkcji 5-fluoro-2'-dezoksyurydyno-5'-monofosforanu (5-FdUMP) z 5-FU lub 5-fluoro-2'-dezoksyurydyny (5-FdUrd) , (ii) wpływ stężenia 5-FdUMP na wewnątrzkomórkowy stosunek 2′-dezoksyurydyno-5′-monofosforanu (dUMP)/tymidyno-5′-monofosforanu (TMP) oraz (iii) stopień wydzielania 5-FdUMP i 5-FU z ludzkich komórek hodowanych przez transportery ABC.W naszych warunkach doświadczalnych komórki inkubowano z 5-FU lub 5-FUrd.Następnie białka komórkowe wytrącono metanolem.Procedura ta zapewniła wysoki odzysk ekstrakcji.Ponadto, aby zmierzyć wydzielanie 5-FU i 5-FdUMP z komórek, przeprowadziliśmy oznaczenie ilościowe tych cząsteczek w pożywce hodowlanej.Pożywki wstrzykiwano bezpośrednio (5-FU) lub poddawano ekstrakcji do fazy stałej przy użyciu wkładu ekstrakcyjnego Oasis Wax (5-FdUMP).Rozdzielanie analitów przeprowadzono na kolumnie dC18 Atlantis 3,5 μm, (100 mm × 2,1 mm średnicy wewnętrznej) w trybie izokratycznym, stosując jako fazę ruchomą bufor mrówczanowy amonu/metanol/woda (5/5/90, obj./obj.).Czas pracy nie przekraczał 6,2 min.Anality jonizowano w interfejsie elektrorozpylania w trybie jonów ujemnych.Zwalidowaliśmy metodę w zakresie 2,5–150 ng ml-1 w zależności od związków.Zmienność wewnątrz- i między testami była niższa niż 10% w ciągu siedmiu dni.Wszystkie związki były stabilne w komórkach lub w pożywce hodowlanej, gdy próbki były przechowywane w temperaturze -20 ° C przez co najmniej dwa tygodnie i po trzech cyklach zamrażania i rozmrażania.W obu podłożach nie zaobserwowano efektu matrycy.