Produkty

Fosforylacja białek reguluje różnorodne funkcje komórkowe i odgrywa kluczową rolę we wczesnym rozwoju roślin.Aby uzupełnić i rozszerzyć wcześniejsze badania fosforylacji białek w sadzonkach Arabidopsis, zastosowaliśmy alternatywne podejście, które łączy ekstrakcję białek w warunkach niedenaturujących z chromatografią powinowactwa immobilizowanych jonów metali (IMAC) w nienaruszonych fosfoproteinach w ekstraktach zubożonych w Rubisco, a następnie identyfikację stosując dwuwymiarową elektroforezę żelową (2-DE) i chromatografię cieczową-tandemową spektrometrię mas (LC-MS/MS).Trawienie trypsyną w żelu i analiza wybranych plam żelowych zidentyfikowała 144 fosforylowanych peptydów i reszt, z których tylko 18 fosfopeptydów i 8 fosfozytów znaleziono w bazach danych miejsc fosforylacji PhosPhAt 4.0 i P3DB Arabidopsis thaliana.Ponad połowa z 82 zidentyfikowanych fosfoprotein była zaangażowana w metabolizm węglowodanów, fotosyntezę/oddychanie lub mechanizmy odpowiedzi na stres oksydacyjny.Wzbogacenie nienaruszonych fosfoprotein przed 2-DE i LC-MS/MS wydaje się poprawiać wykrywanie fosforylowanych reszt treoniny i tyrozyny w porównaniu z metodami wykorzystującymi wzbogacanie na poziomie peptydów, co sugeruje, że te dwa podejścia są w pewnym stopniu komplementarne pod względem pokrycia miejsca fosforylacji.Porównując wyniki dla młodych sadzonek z wynikami uzyskanymi wcześniej dla dojrzałych liści Arabidopsis, zidentyfikowano pięć białek, które są różnie fosforylowane w tych tkankach, co wskazuje na potencjał tej techniki do badania dynamiki fosforylacji białek podczas rozwoju roślin.