Produkty

Analiza zdarzeń fosforylacji w całym proteomie jest nadal dużym wyzwaniem analitycznym ze względu na ogromną złożoność sieci fosforylacji białek.W tej pracy oceniamy komplementarność Lys-N, Lys-C i trypsyny pod kątem ich zdolności do udziału w globalnej analizie fosfoproteomu.Udoskonaloną wersję silnego wymieniacza kationowego o niskim pH zastosowano do skutecznego oddzielenia N-końcowo acetylowanych, fosforylowanych i niezmodyfikowanych peptydów.W sumie 5036 nieredundantnych fosfopeptydów można było zidentyfikować ze wskaźnikiem fałszywego wykrywania <1% z 1 mg białka przy użyciu kombinacji trzech enzymów.Nasze dane ujawniły, że nakładanie się zestawów danych fosfopeptydów generowanych przy użyciu różnych proteaz było marginalne, podczas gdy nakładanie się dwóch podobnie wygenerowanych zestawów danych trypsyny było co najmniej 4 razy wyższe.W ten sposób równoległe stosowanie Lys-N i trypsyny umożliwiło 72% wzrost liczby wykrytych fosfopeptydów w porównaniu z samą trypsyną, podczas gdy eksperyment z replikacją trypsyny doprowadził jedynie do 25% wzrostu.Tak więc, skupiając się wyłącznie na danych dotyczących trypsyny i Lys-N, zidentyfikowaliśmy 4671 nieredundantnych fosfopeptydów.Dalsza analiza wykrytych miejsc wykazała, że ​​zestawy danych Lys-N i trypsyny zostały wzbogacone o znacząco różne motywy fosforylacji, co dodatkowo dowodzi, że podejścia wieloproteazowe są bardzo cenne w analizach fosfoproteomu.